Di laboratorium kadang
dengan pewarnaan sediaan hapus darah tepi menggunakan metode Giemsa atau Wright
belum memuaskan untuk membedakan seri leukosit untuk menunjang diagnosis
leukemia dan kelainan leukosit, oleh sebab itu diperlukan pewarnaan sitokimia
lainnya. Dalam bahasan kali ini membahas mengenai pewarnaan (pulasan)
peroksidase, Sudan Black, Periodic Acid Schiff (PAS) dan Leukocyte Alkaline
Phosphatase (LAP).
XIV.2 PULASAN PEROKSIDASE
Adakalanya membedakan
jenis leukosit menemui kesukaran, teristimewa jika menghadapi sel muda atau
yang abnormal. Dalam keadaan ini boleh digunakan bahwa granula dalam sel
jajaran granulosit dan monosit mengandung peroksidase, sedangkan sel jajaran
limfosit tidak ada. Pulasan peroksidase yang sering digunakan menurut Sato dan
Sekiya.
XIV.1.1 Sato dan Sekiya
Larutan yang diperlukan :
1. Larutan Cupri Sulfat :
CuSO4.5H2O 0,5 gram dalam 100 ml aquadest.
2. Larutan benzidine :
benzidine basa 0,2 gram digerus dalam cawan porselin dalam 200 ml aqudest.
Disaring dan tambahkan 0,25 ml H2O2 3% dan simpan dalam
botol coklat. Tahan selama 6 bulan.
3. Larutan Safranin :
safranin 1 gram dalam 100 ml aquadest.
Cara :
1. Letakkan sediaan kering
dan difiksasi di atas rak.
2. Genangi sediaan dengan
larutan kuprisulfat selama 30 – 60 detik.
3. Buang larutan tadi dan
genangi dengan larutan benzidine selama 2 menit.
4. Bilas dan warnai dengan
larutan safranin selama 1 menit.
5. Bilas dan keringkan.
Hasil :
Plasma jajaran granulosit berwarna biru sedangkan
granula berisi peroksidase akan berwarna hijau biru. Mielobast dengan hasil
negatif. Monosit memiliki granula namun terlihat kecil-kecil. Limfosit tidak
ada dan berwarna merah.
XIV.1.2 Ellias
Larutan
yang digunakan :
1. Larutan Chloronaftol.
Larutkan 15 mg 4-chloro-1-naftol dalam 2 ml etanol absolut, simpan suhu 4°C.
2. Buffer Tris. Larutan 19,2
ml larutan Tris-(hidroksimetil) aminometan 0,2 mol/L dicampur dengan 80,8 ml
HCl 0,1 mol/L, kemudian tambahkan air sampai 500 mL. pH harus 7,4 – 7,6.
3. Larutan H2O2
segar : 0,4 mL H2O2 30% diencerkan dalam 100 mL aquadest.
4. Larutan methylgreen 1%
dalam aquadest.
Larutan peroksidase
dibuat dengan mencampur 2 mL larutan Chloronaftol dengan 38 mL buffer Tris.
Kemudian ditambahkan 1 mL H2O2.
Cara :
1. Sediaan digenangi dengan
reagent peroksidase selama 10 menit.
2. Bilas dengan air dan
warnai dengan larutan methylgreen selama 2 menit.
3. Bilas dengan air dan
keringkan.
Hasil :
Pulasan
ini membuat granula yang peroksidase positif (+) berwarna biru tua.
XIV.3 PULASAN SUDAN BLACK
Zat warna Sudan Black
memberi warna hitam kepada granula dalam leukosit yang mengandung zat lemak.
Antara sudanofilia dan reaksi peroksidase positif terhadap korelasi positif.
Larutan yang diperlukan :
1. Larutan Sudan Black : 0,5
gram Sudan Black B dicampur dengan 100 mL etanol absolut. Biarkan selama 2 hari
dan saring.
2. Larutan Buffer : Phenol
16 gram, etanol absolut 30 mL, Na2HPO4.12H2O
0,3 gram dan aquadest 100 mL.
3. Larutan kerja : dicampur
60 mL larutan Sudan Black dan 40 mL Buffer. Saring.
Cara :
1. Sediaan direkatkan dengan
uap formalin dalam wadah tertutup selama 10 menit.
2. Genangi sediaan dengan
larutan kerja selama 30 menit.
3. Bilas dengan etabol
absolut dan bilas dengan air.
4. Bisa juga di warnai
dengan safranin 0,1 %.
Hasil :
Granula
yang mengandung lipid/lemak akan berwarna hitam.
XIV.4 PULASAN PAS (PERIODIC ACID SCHIFF)
Pulasan ini berguna untuk
mengenali sel-sel dalam jajaran limfosit yang mengandung glikogen. Reaksi yang
terjadi adalah oksidasi glikogen oleh asam periodat (periodic acid)
menjadi aldehide, lalu bereaksi dengan reagen schiff menjadi warna merah.
Larutan
yang diperlukan :
1. Larutan asam periodat :
HIO4. 2H2O 1 gram dalam 100 mL aquadest.
2. Reagent Schiff : Basic
Fuchsin 1 gram dimasukkan dalam 400 mL air mendidih, biarkan dingin sampai
50°C, saring, tambah 1 mL thionylchloride (SOCl2), simpan tempat
gelap 24 jam, tambah 2 gram carbon adsorbens, kocok saring, simpan lemari es
dalam botol gelap.
3. Larutan hematoksilin 2
gram dalam 100 mL aquadest.
Cara :
1. Sediaan hapus direkatkan
denga uap formalin dalam cawan petri selama 10 menit.
2. Bilas dengan air selama
15 menit.
3. Genangi sediaan dengan
asam periodat selama 30 menit.
4. Bilas dengan aquadest,
genangi dengan reagent schiff selama 30 menit.
5. Bilas dengan air, bilas
dengan aquadest selama 5 menit.
6. Genangi dengan
hematoksilin selama 10 menit.
Hasil :
Granula dalam leukosit yang berisi glikogen menjadi merah.
XIV.5 PULASAN FOSFATASE ALKALIS (LAP)
Adanya enzim ini dalam
granula dan sitoplasma sel-sel jajaran granulosit dapat dipergunakan untuk
membedakannya dari leukosit-leukosit lainnya. Hasil pulasan ini memberikan
petunjuk dalam membedakan leukositosis oleh leukemia granulositik kronik dari
leukositosis oleh sebab-sebab lain.
Darah segar sebaiknya
digunakan : kapiler, darah vena dengan antikoagulan heparin atau double oxalat.
Darah EDTA tidak boleh digunakan karena mengganggu pulasan.
Metode Kaplow LAP
Larutan yang diperlukan :
1. Larutan perekat :
formalin (40%) 10 mL, metanol absolut 90 mL. simpan dalam lemari es freezzer.
Sebagian larutan diambil dan ditaruh pada suhu 5°C.
2. Larutan stok propanadiol
: 2-amino-2-metil-1,3-propanadiol 10,5 gram dalam aquadest 500 mL.
3. Larutan kerja Buffer
Proponadiol : larutan stock proponadiol 0,2 M 25 mL, larutan HCl 0,1 N 5 mL dan
aquadest 100 mL dan pH harus 9,75 dan simpan dalam lemari es.
4. Larutan substrat pH 9,5 –
9,6 : natrium alfa naftil fosfat 35 mg. fast blue RR 35 mg, larutan kerja
proponadiol 35 mL, saring. Larutan ini harus segar dan tidak boleh ditunda.
5. Larutan hematoksilin
menurut Harris.
Cara :
1. Sediaan hapus digenangi
dengan larutan perekat bersuhu 5°C selama 30 detik.
2. Bilas dengan air mengalir
selama 10 detik.
3. Genangi sediaan dengan
larutan substrat selama 15 menit.
4. Bilas dengan air mengalir
selama 10 detik.
5. Pulas tanding dengan
larutan hematoksilin selama 4 menit.
6. Bilas dengan air mengalir
selama 10 detik dan biarkan kering.
Hasil :
Adanya fosfatase alkalis dalam leukosit ditandai
dengan warna coklat muda hingga hampir hitam.
Penilaian :
0 : netrofil tidak berwarna
coklat
1 : coklat sangat muda
merata, jarang granula.
2 : coklat lebih tua
merata, granula sedang jumlahnya.
3 : warna tegas dan granula
banyak.
4 : warna tegas dan granula
berdekatan dan warna sangat tua.
Skorsing
(100 leukosit) :
>100
: LAP tinggi
20 – 70
: LAP normal
<15
: LAP rendah
Interpretasi
klinis :
Leukositosis
oleh infeksi menghasilkan score LAP tinggi, pada leukemia granulositik kronik
score LAP rendah.
0 komentar:
Posting Komentar